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          组织研磨机对提取小鼠尾巴RNA的实验步骤
          发布时间:2016-12-12   点击次数:1747次

          实验步骤

          1、首先将上海净信的组织研磨机上的制冷模块预先置于-20℃,使用时取出安装好。将研磨珠去RNA酶处理。

          2、随机抽取小鼠的尾巴100µg,把样本剪成尽可能小段,置于无RNA酶的2研磨单位离心管中(选择耐液氮冷冻管子),同时加入1颗5号研磨珠和2颗3号研磨珠(如果选择1.5研磨单位离心管,只需要加入4-5颗3号研磨珠)。

          3、放置于液氮中一起浸泡3分钟,取出放置于预冷模块中,在全自动样品研磨仪上选择13单位频振研磨60s。(该步骤可以根据研磨的细微程度要求可以再重复一遍)

          4、把研磨好的样本加入0.06ml的PBS0.14ml的RNAiso Plus(此处选择PBS,可以根据实验需要加入其他提取液,如1ml TRIzol等),继续置于研磨机上选择13单位频振研磨60s。样本将处于糊状。(其他提取试剂有可能会出现泡沫,不影响实验)

          5、取出研磨管,放入冷冻离心机中,于4度,12000g离心10分钟

          6、小心吸取上清液0.1ml至新的1.5研磨单位离心管中,盖上管盖,在室温上孵育15分种,使样品充分裂解至匀浆液较透明,如果仍有少量颗粒属于正常情况,不影响RNA提取质量和得率。

          7、在1.5研磨单位离心管中加入0.02ml,盖紧管盖,振荡混匀并将其在冰上孵育15分种,于4度,12000g离心15分钟。离心后混合物分层:上清层,中间层,下层;RNA存在于上清层中。

          8、将上清层小心转移到一干净的离心管中,加入等体积冰浴的异丙醇,颠倒振荡混匀,将混合的样品在-20度条件,孵育20分种,于4度,12000g离心10分钟。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。

          小心弃去上清,用1ML的冰浴75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次,颠倒洗涤离心管管壁,并旋涡振荡样品,尽可能让沉悬浮,于4度,12000g离心5分钟,再次去除上清,晾干沉淀。

          10、操作的后,在阴凉处适度干燥RNA沉淀(避免过分干燥,那样会降底它的可溶性)。

          11、用适量(一般可用0.01—0.02ml)的无RNA酶水或TE溶液来溶解RNA。抽提好的RNA,保存于-70度。

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